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战疫中

时间:2021-09-11 22:54:44

截止至 2020 年 2 月 10 日 17 时,2019-nCoV 所致的肺炎死亡率为 2.3% 左右。可以预见,进一步研究 2019-nCoV 病毒感染致病机制,进而针对性开发有效药物,最终降低新型冠状病毒肺炎的死亡率,将是今后新冠肺炎防治工作和相关科学研究的重要组成部分。但问题是:● 治疗新型冠状病毒肺炎未来药物可能会有哪些?● 可以直接用恢复期病人体内的抗体开发单抗药吗?● 哪些靶点可能会成为未来抗 2019-nCoV 病毒特异性药物靶点?● 靶向炎症因子(或受体)的单抗药/拮抗剂的免疫调节疗法会有效吗?本文结合多篇文献及最新研究进展对上述问题进行阐述,阅读时间约 5-10 分钟,欢迎回复讨论。导 读Remdesivir 和单抗药组合被认为可能是理想的 2019-nCoV 肺炎治疗方法,未来研发抗 2019-nCoV 病毒的特异性治疗药物(如单抗药)和有效减轻肺部病变症状的药物是治疗新冠肺炎一个重要方向。基于 2019-nCoV 病毒的基因组与 SARS-CoV 相似度较高,进入细胞模式可能都利用 Spike 蛋白和宿主受体 ACE2 结合,由相同的宿主蛋白酶 TMPRSS2、Cathepsin B/L 来切割 Spike 蛋白介导进入宿主细胞,ACE2、TMPRSS2 和 Cathepsin B/L 显示出作为抗 2019-nCoV 病毒药物靶点的潜在价值。另外,科学家发现新冠肺炎患者血浆 Th1 细胞反应激活(IL1B、IFNγ、IP10 和 MCP1 上调),Th2 炎症因子 IL4 和 IL10 也上调,明确新冠肺炎肺病变的病理生理机制对研发/应用减轻肺部病变症状药物非常关键。一、治疗新型冠状病毒肺炎未来药物可能会有哪些?针对 2019-nCoV 的药物开发,Hongzhou Lu 总结出方法主要有三类:1. 测试现有的广谱抗病毒药物,如 I 型、II 型干扰素;2. 筛选小分子化学药库;3. 基于基因组和生物物理学信息重新开发特异针对新型冠状病毒的药物,包括 siRNA 和特异性病毒抑制剂等。潜在的有效药物包括 1 :Lopinavir/Litonavir(抑制和 2019-nCoV 同样属于 RNA 病毒的 HIV-1,2 的蛋白酶),核苷类似物(如 Fabiravir 和 Ribavirin,抑制病毒核苷酸生物合成),神经氨酸酶抑制剂(如 Oseltamivir、Zanamivir 和 peramivir),融合肽(如 EK1),Abidol,RNA 合成抑制剂(如 TDF、3TC),抗炎药(如激素和其他化合物),部分中药制剂以及最近备受关注的 Remdesivir(瑞德西韦,在研的广谱抗病毒药,核苷酸类似物,抑制 RNA 合成酶)。► 备受关注和期待的瑞德西韦 瑞德西韦(Remdesivir)是吉利德(Gilead)科学公司开发的一种广谱的抗病毒核苷类似物,在体外实验已显示出抗 RNA 病毒活性,如 Ebola(埃博拉病毒)、Marburg(马尔堡病毒)、RSV(呼吸道合胞体病毒)、NiV(尼帕病毒)、Hendra(亨德拉病毒) 2-4 。Remdesivir 在稍早 2020 年 1 月 10 日被报道在细胞和小鼠模型中具有抗 MERS-CoV(中东呼吸综合症冠状病毒)、改善肺功能、减少病毒载量以及减少肺部病变的功能 5。Manli Wang 等报道在 Vero E6 细胞模型中,Remdesivir 显示出了抑制 2019-nCoV 病毒感染的效果,半数有效浓度 EC50 为 0.77μM,选择指数 SI 大于 129.87 6,然而其安全性和有效性还未被证实,且尚未在任何国家获批上市。鉴于 2019-nCoV 和 MERS-CoV 同属冠状病毒 7,8,且结构类似,其抗 2019-nCoV 潜力巨大。Michelle L. Holshue 等报道在对新冠肺炎发病第 7 天的 1 例患者同情性地给予在研药 Remdesivir 治疗 1 天后,患者症状明显改善,并最终痊愈 9。2020 年 2 月 3 日,Remdesivir 治疗 2019-nCoV 的临床试验在北京中日友好医院启动,其临床实验结果预计在几个星期内对外公布。结合近期 Regeneron 公司开发抗 MERS 病毒单克隆抗体的进展,Vanderbilt 大学医学中心 Mark Denison 认为理想的 2019-nCoV 肺炎治疗方法可能是 Remdesivir 和抗病毒特异性单抗药物的组合给药。抗病毒特异性单抗药可以设计为阻断病毒特异性感染细胞过程中关键的宿主/病毒蛋白,阻止病毒感染宿主细胞,或是靶向病毒的关键蛋白而使其失活,故可选择开发靶向性更好的单抗药治疗 2019-nCoV 肺炎。二、可以直接用恢复期病人体内的抗体开发单抗药吗?的确,利用恢复期病人的抗体来开发抗病毒单抗药是一个很有吸引力的设想。人们陆续发现在临床上,用恢复期病人的血浆去治疗 SARS-CoV 10、1918 和 2009 H1N1、H5N1 流感病毒 11-13 感染的患者产生了良好的效果,尤其在疾病症状初起时应用效果更好 14,目前还没有报道用 2019-nCoV 所致肺炎患者的血浆去测试抗 2019-nCoV 病毒效果,值得注意的是,马来源的抗 SARS-CoV 血清在体外 1:80 稀释显示出较强的中和 2019-nCoV 病毒效果 8。但是恢复期病人血浆较难获得,且中和抗体的滴度较低,会阻碍该方法在临床上的应用 15 。因此,分离病毒感染的病人或接种疫苗的个体浆细胞或记忆 B 细胞筛选重组生产中和抗体即是一个可替代的方案 15。那么利用恢复期病人的抗体来开发抗病毒单抗药设想的实现流程可以是:1. 分离恢复期病人的外周血单个核细胞;2. 流式分选可以与抗原结合的阳性 B 细胞,并以一孔一个细胞的密度把 B 细胞种在微孔板内;3. 反转录 B 细胞的 RNA 为 cDNA 后,设计针对人源 IgG 的引物,对其轻重链的高变区进行 PCR 和测序,构建在抗体表达载体上;4. 在细胞模型中进行单克隆抗体轻重链配对,筛选配对成功的单克隆抗体;5. 进一步用单克隆抗体进行病毒中和检测,筛选最佳克隆作为单抗药候选。此外,利用实验动物,如小鼠、兔子和豚鼠等的抗体做嵌合化的人源抗体技术已日趋成熟,即将抗原免疫动物后分离筛选单克隆 B 细胞,扩增其表达抗体的 CDR 序列构建至人源化抗体表达载体上,筛选鉴定后,生产人源化单抗。当然,生产出的候选单克隆抗体药还必须进一步通过大量临床前实验和临床实验的严格验证。关于生产中和抗体的抗原的选择(或病毒特异性药物靶点),可以是病毒复制所用酶、宿主受体/蛋白酶、介导宿主内吞蛋白、病毒 S1 RBD、S2 结构域等 1。三、哪些靶点可能会成为未来抗 2019-nCoV 病毒特异性药物靶点?在考虑选择抗 2019-nCoV 病毒特异性药物靶点之前,需要我们对 2019-nCoV 病毒感染宿主的分子机制有充分的认识。冠状病毒进入细胞的分子机制是一个多步骤的过程:Spike 蛋白介导了与宿主细胞表面受体结合,随后宿主蛋白酶切割 Spike 蛋白,最后膜融合病毒进入宿主细胞 16-18。SARS-CoV 病毒经 Spike 蛋白的 RBD 结构域和宿主细胞受体 ACE2 结合而进入宿主细胞,而不是通过宿主细胞受体 DPP4 和 APN 来介导(图 1)18,19。MERS-CoV 病毒通过 DPP4 受体 17,HCoV-229E 病毒通过 APN 受体 20,HKU5 和 PDF-2180 病毒通过未知的受体进入人体细胞 21。图 1 SARS-CoV Spike 蛋白通过 RBD 结构域和宿主细胞受体 ACE2 结合(PDB:5X5B,2AJF)19目前已有三项研究(Peng Zhou 等、Michael 等、Markus Hoffmann 等)在细胞水平上证明了 2019-nCoV 病毒与 SARS-CoV 病毒一样,通过宿主细胞受体 ACE2(血管紧张素转化酶 2),而非 DPP4 或 APN 受体来进入宿主细胞 8,18,19。而在蛋白酶切割 Spike 蛋白阶段,对于 TMPRSS2- 细胞系(如 293T 细胞),2019-nCoV-Spike 和 SARS-CoV-Spike 均由 Cathepsin B/L 来切割 Spike 蛋白来介导病毒进入宿主细胞。而对于 TMPRSS2+ 细胞系(如 Caco-2 细胞),2019-nCoV-Spike 和 SARS-CoV-Spike 均由 TMPRSS2 来切割 Spike 蛋白来介导病毒进入宿主细胞 18,因此,可能与 SARS-CoV 一致,2019-nCoV 病毒利用了宿主蛋白酶 Cathepsin B/L 或 TMPRSS2 来切割 Spike 蛋白介导进入宿主细胞的过程。前述的研究表明,在体内 2019-nCoV 病毒和 SARS-CoV 病毒可能都利用了相同的宿主细胞表面受体和蛋白酶来介导进入宿主细胞的过程,提示着 ACE2 和 TMPRSS2 作为抗 2019-nCoV 病毒药物靶点的潜在价值。四、靶向炎症因子(或受体)的单抗药/拮抗剂的免疫调节疗法会有效吗?2019-nCoV 病毒所致肺炎以单/双侧肺斑片状或节段性磨玻璃密度影的 CT 表现为显著特征之一,说明患者肺部产生病变 22。研究 2019-nCoV 病毒所致肺炎病理生理机制,并据此开发药物减轻患者肺部病变症状和阻断病变进展也是治疗新冠肺炎重要的一部分。人们发现 SARS 患者血清中上调的炎症因子(IL1B、IL6、IL12、IFNγ、IP10 和 MCP1)与肺部炎症和损伤存在密切的关联 23。而 MERS 患者表现出了 Th1 和 Th17 反应,即 IFNγ、TNFα、IL15 和 IL17 的上调 24。上述发现不难让人想到炎症因子的上调也和 2019-nCoV 所致肺炎严重程度相关 22。Chaolin Huang 等率先报道了 2019-nCoV 所致肺炎患者的血浆中的炎症因子表达情况,作者发现不仅 Th1 细胞反应激活(IL1B、IFNγ、IP10 和 MCP1 上调),Th2 炎症因子 IL4 和 IL10 也上调,除此以外,ICU 患者血浆中的 IL2、IL7、IL10、GCSF、IP10、MCP1、MIP1A 和 TNFα要比非 ICU 患者的要高,暗示这些炎症因子的表达水平和疾病严重程度可能相关 22。下表中的炎症、趋化因子和生长因子在 2019-nCoV 病毒感染后上调。糖皮质激素通过和细胞的皮质激素受体结合调控抗炎基因转录起到抑炎的效果 34,其在治疗 SARS 和 MERS 广泛使用,以及正在用于治疗新冠肺炎 35。但是 WHO 专家 Clark D Russell 等基于皮质激素在抑制免疫反应的同时会延长 SARS-CoV 和 MERS-CoV 病毒 RNA 清除时间以及引发继发损害和并发症等事实,认为应该避免使用皮质激素作为治疗 2019-nCoV 引起的肺损伤或休克的治疗方法 35。因此,利用单抗药或拮抗剂进行抗炎症因子(或受体)的疗法可能是减轻细胞因子风暴引起的肺损伤、多器官失能和 ARDS 的可考虑的另一种思路:即随着未来人们对新冠肺炎细胞因子风暴的产生机制了解更为清晰,针对关键的炎症因子(或受体)应用单抗/拮抗剂阻断炎症信号。 但在治疗新冠肺炎中抑制细胞因子风暴的产生能否降低致死率,提高疾病预后,还需要更多研究工作去阐明。五、新型冠状病毒肺炎研究工具为了加快新型冠状病毒相关研究和药物研发,Abcam 提供 2019-nCoV 病毒识别的宿主受体和蛋白酶的抗体,炎症因子/趋化因子的 ELISA 试剂盒,IgG/IgM 二抗等产品。2019-nCoV 和 SARS-CoV 病毒基因序列存在约 79% 的同源性,因而 SARS-CoV 的重组蛋白、抗体仍然值得尝试。以下是精选产品:参考文献:1 Lu, H. 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